4. LA DIAGNOSI PRENATALE:
LE INFORMAZIONI,
LA CONSAPEVOLEZZA E LE SCELTE

Con questo capitolo non ci limiteremo alla diagnosi prenatale della sola sindrome di Down (SD), ma cercheremo di fornire un’aggiornata panoramica di questo delicato e complesso problema, affrontando i diversi aspetti della diagnosi prenatale: indicazioni, tecniche di prelievo, problemi di laboratorio (2,3,4).

È utile rammentare le caratteristiche peculiari della diagnosi prenatale, così come vengono precisate nel documento del Comitato Nazionale di Bioetica (19.09.1999 ) dal quale sono tratti i seguenti punti (5).

a) La diagnosi prenatale viene effettuata non sulla persona che ne fa richiesta, bensì su un soggetto, che nell’attuale legislazione, non ha riconoscimento giuridico.

b) La diagnosi prenatale, in considerazione dell’epoca in cui si effettuano le indagini, non permette di correlare in tempo reale il fenotipo con il genotipo. Pertanto in alcuni casi (es. malformazioni evidenziate tramite esame ecografico) non è possibile formulare una precisa diagnosi.

Qualora vengano applicate indagini genetiche è possibile identificare la specifica mutazione (es. anomalia cromosomica, difetto genico ecc.) e quindi il test ha un valore diagnostico anche se il fenotipo potrà essere verificato con certezza solo al momento della nascita a termine o dopo interruzione volontaria di gravidanza.

Nelle patologie ad insorgenza tardiva (es. malattia di Huntington, distrofia miotonica ecc.) il test genetico si configura tra quelli di tipo “presintomatico”

c) La diagnosi prenatale deve essere eseguita entro tempi molto più brevi rispetto al periodo post-natale.

d) Molto spesso la diagnosi di feto affetto si basa sul referto di un solo test genetico e su questa unica informazione la coppia deve scegliere se continuare o interrompere la gravidanza. Non vi è, forse, altra situazione nella vita di un uomo in cui una malattia venga accertata sulla base di una sola indagine; questo pone gli interessati ma anche il personale sanitario in una situazione psicologica particolarmente complessa, delicata e drammatica.

e) La coppia deve essere informata dei rischi e deve ricevere indicazioni appropriate nell’ambito di una consulenza genetica offerta prima e dopo l’indagine.

f) La diagnosi prenatale consente di attuare, ove possibile, interventi terapeutici per il trattamento del feto/neonato affetto sia in utero che alla nascita.

g) La diagnosi prenatale consente alle coppie a rischio di realizzare il progetto di famiglia attraverso scelte procreative consapevoli.

L’attuazione di queste finalità deve avvenire nel rispetto dei principi etici:

-    di autonomia della madre o della coppia;

-    di beneficio ( bene facere) nei confronti dei genitori e del feto;

-    della normativa vigenti.

Inoltre per offrire prestazioni corrette è necessario che le strutture impegnate negli interventi di consulenza, di prelievo, di analisi genetiche e di assistenza abbiano elevati standard di qualità e siano efficacemente coordinati.

LE INDICAZIONI ALLA DIAGNOSI PRENATALE

La presenza di un rischio di complicanze e la limitatezza delle risorse economiche del sistema sanitario ha per decenni orientato la Sanità Pubblica all’utilizzo della diagnosi prenatale su una precisa indicazione clinica. Questo è sempre stato motivato da quello che è l’obiettivo sociale, anche se spesso non dichiarato della diagnosi prenatale, cioè individuare il numero più elevato possibile di feti affetti con una percentuale minima di perdite fetali.

Le indicazioni più frequenti riguardano un rischio riproduttivo aumentato rispetto alla popolazione generale per una particolare patologia genetica (cromosomica o genica).

In questi casi, come già accennato, la diagnosi prenatale trova indicazione se il quadro clinico di cui può essere affetto il feto sia grave ed incurabile oppure nei casi in cui sia necessaria una diagnosi al fine di instaurare terapie precoci, anche in utero, o predisporre modalità particolari per l’espletamento del parto.

In linea generale la diagnosi prenatale si pone in due situazioni di rischio:

a) gravidanze in cui il rischio procreativo aumentato sia prevedibile “a priori”, ad esempio: età materna avanzata; genitore portatore eterozigote di anomalie cromosomiche strutturali; genitore o genitori portatori di mutazioni geniche.

b) gravidanze in cui la probabilità che il feto sia affetto si evidenzia durante la gestazione. Ne sono esempi: le malformazioni riscontrate all’ecografia; i valori degli screening ecografici (misurazione della translucenza nucale fetale) oppure biochimici (effettuati su sangue materno) che evidenziano un aumentato rischio di feto affetto da SD o da altra anomalia cromosomica; malattie infettive contratte dalla madre in gravidanza.

Attualmente oltre l’80% delle diagnosi prenatali, eseguite per individuare patologie genetiche fetali, interessano l’indagine citogenetica.

Le principali indicazioni all’indagine citogenetica sono:

- età materna avanzata (uguale o superiore a 35 anni),

- genitori con precedente figlio affetto da patologia cromosomica,

- genitore portatore di riarrangiamento strutturale non associato ad effetto fenotipico, cioè bilanciato,

- genitore con aneuploidie dei cromosomi X o Y, compatibili con la fertilità,

- malformazioni fetali evidenziate mediante l’ecografia,

- probabilità di 1/250 o maggiore che il feto sia affetto da SD (o da alcune altre aneuploi-die) sulla base dei parametri di screening ecografici o biochimici (TN; duo-test, tri-test; ecc.),

- sindromi mendeliane da rotture cromosomiche (Anemia di Fanconi; Atassia Telangiectasia) e Sindrome di Roberts,

- indicazioni particolari valutate singolarmente da specialisti del settore.

Età materna avanzata (≥ 35 anni)

La correlazione tra età materna avanzata ed aumento delle trisomie autosomiche e delle polisomie X (tra cui XXY e XXX) è chiaramente documentata da numerosi studi epidemiologici relativi a nati vivi, a feti in diagnosi prenatale e ad aborti spontanei (Tab. 1). Il numero di neonati con SD o con una delle altre patologie cromosomiche alla nascita è mediamente del 30% inferiore a quella riscontrata anatomopatologicamente in epoca prenatale. Questa differenza è in parte motivata dal fatto che, tra il secondo trimestre ed il termine di gravidanza, una percentuale di feti con anomalie del cariotipo viene spontaneamente abortita.

La scelta dei 35 anni ed oltre, generalmente accettata quale limite per l’accesso gratuito ai servizi di diagnosi prenatale del sistema sanitario Nazionale può sembrare arbitraria poiché il rischio di figlio affetto aumenta gradatamente con l’età e quindi la valutazione di “maggiore o minore, accettabile o no” è assolutamente soggettiva ed individuale. Tuttavia considerazioni relative alle probabilità di aborto correlate alle tecniche di prelievo ed ai limiti posti dalla spesa hanno portato all’identificazione di questa soglia.

L’età di 35 anni è anche il requisito minimo, almeno per alcune Regioni, per ottenere l’esame cromosomico fetale quando l’analisi sia stata chiesta per altre indicazioni, ad esempio il rischio di una malattia genica.

Tab. 1 Rapporto tra età materna al concepimento e prole con trisomia 21 alla nascita da Geleherter T D, Collins S C,Ginsburg D., Genetica medica, Masson Ed. 1999.

Genitori con precedente figlio affetto da patologia cromosomica

Gli studi sulla diagnostica prenatale hanno messo in evidenza che genitori, di età inferiore ai 35 anni, che abbiano già avuto un figlio affetto da trisomia 21 o altra aneuploidia hanno una maggiore probabilità di ripetizione di anomalia numerica dei cromosomi rispetto a coppie di pari età con anamnesi familiare negativa. L’aumento di rischio (circa 20 volte maggiore) potrebbe essere dovuto alla presenza di un mosaicismo gonadico parentale, ad una predisposizione genetica alla non-disgiunzione o a fattori esogeni non facilmente individuabili. importante per la coppia è la conoscenza del dato empirico per l’eventuale monitoraggio di successive gravidanze.

Genitori con precedente figlio affetto da patologia cromosomica

Circa 1/400 individui è portatore di un riarrangiamento strutturale bilanciato dei cromosomi, quindi a rischio, ad ogni concepimento, di generare un figlio con un’anomalia cromosomica sbilanciata. Esempi di questo gruppo di anomalie sono le traslocazioni e le inversioni.

In base all’esperienza clinica, è noto che la percentuale dei neonati affetti da anomalia cromosomica sbilanciata, derivata da una trasmissione parentale, è inferiore a quella che può essere calcolata teoricamente, in quanto entrano in gioco meccanismi di selezione naturale quali: la selezione degli spermatozoi o ovociti anche nella fase pre-impianto, a vantaggio di quelli con cariotipo normale, oppure l’aborto spontaneo degli embrioni con cariotipo sbilanciato nel corso delle prime settimane gestazionali.

Malgrado non sia stato dimostrato un aumento del rischio procreativo per questa categoria di persone, la diagnosi prenatale non viene rifiutata, qualora richiesta dalla coppia.

Malformazioni fetali evidenziate ecograficamente

Come descritto più avanti, l’indagine ecografica eseguita, nel I e II trimestre di gravidanza, permette di evidenziare anomalie strutturali del feto e degli annessi, di valutare la crescita fetale e variazioni della quantità del liquido amniotico. In questi ultimi 10 anni sono stati condotti ampi studi (2,6) che hanno permesso di correlare malformazioni fetali, isolate o multiple, ed anomalie dello sviluppo fetale (IUGR) con anomalie cromosomiche o geniche. La scelta del percorso diagnostico da seguire dopo la diagnosi ecografica di malformazioni fetali è la conseguenza di un lavoro d’equipe che unisce le competenze dell’ostetrico, del genetista e le risorse del laboratorio.

Si tratta di uno degli ambiti più problematici della diagnosi prenatale per la difficoltà alla definizione prognostica nei casi in cui l’esame cromosomico sia negativo.

LE TECNICHE OSTETRICHE NELL'INDAGINE PRENATALE

È opportuno considerare separatamente le tecniche ostetriche tradizionali per la diagnosi prenatale dalle tecniche che si sono affacciate più recentemente nella pratica clinica, mantenendo ancora aspetti sperimentali o perlomeno poco routinari. Nel primo gruppo consideriamo l’ecografia, l’amniocentesi, il prelievo di villi coriali, il prelievo di sangue fetale e le biopsie fetali. Nel secondo gruppo sono incluse la diagnosi genetica preimpianto e l’identificazione di cellule fetali o del DNA fetale, nel sangue materno.

L'ecografia

L’ecografia ostetrica rappresenta una tecnica di estrema importanza in diversi ambiti della diagnosi prenatale. Essa va considerata una tecnica diagnostica vera e propria quando è utilizzata per lo studio morfologico fetale oppure una tecnica di ausilio nell’ambito di procedure di prelievo di tessuti fetali.

L’ecografia come tecnica diagnostica

Le malformazioni congenite hanno una frequenza alla nascita nella popolazione generale del 3-5% e si verificano, nell’ 80-90% dei casi, in coppie senza un rischio identificabile a priori.

Mentre nella popolazione ad alto rischio l’indagine è mirata, essendo note le anomalie da ricercare, in quella a basso rischio lo screening deve prevedere una valutazione accurata di tutta l’anatomia fetale in un’epoca di gravidanza tale da consentire la visualizzazione del maggior numero di malformazioni senza precludere la possibilità (in caso di patologie gravi per le quali non esista attualmente terapia) di interrompere la gravidanza nei termini previsti dalla legge. Quest’epoca è stata individuata dalla maggior parte degli autori (7) nel periodo compreso tra la 20^a e la 22^a settimana di gestazione.

Sono stati effettuati diversi studi, prospettici e retrospettivi (8,9,10), sull’efficacia dell’indagine ecotomografica prenatale nella diagnosi delle malformazioni congenite. i risultati sono stati spesso contrastanti, con valori di sensibilità compresi tra 37.8% e 99% e con specificità sempre superiore al 99%. L’ampia variazione della sensibilità è attribuibile a diversi fattori, tra cui il tipo e la gravità dell’anomalia, il criterio di selezione delle pazienti, l’esperienza degli operatori, il tipo di ecotomografo utilizzato.

Quando l’ecografia viene utilizzata come test diagnostico per anomalie selezionate, in pazienti ad alto rischio, e non come metodica di screening, la sua sensibilità risulta sempre molto elevata (range compreso tra il 73% ed il 99%). Inoltre, in questi casi, l’ecografia viene sempre eseguita in centri specializzati (II e III livello) da operatori esperti e con ecotomografi dell’ultima generazione.

La sensibilità dell’ecografia nella diagnosi delle malformazioni fetali può variare considerevolmente anche nell’ambito dei singoli studi anche per numerose altre cause:

• difficoltà tecniche che comportano una visualizzazione del feto non ottimale (obesità materna, posizione fetale, oligoamnios, polidramnios, gravidanza multipla);

• assenza di segni ecografici della malformazione (fistola tracheo-esofagea, SD senza evidenti anomalie strutturali);

• comparsa tardiva dei segni ecografici (atresia duodenale, ostruzione del piccolo intestino, idrocefalia, microcefalia, uropatie ostruttive);

• scarsa collaborazione della paziente.

Da quanto detto risulta evidente come la sensibilità dell’indagine ecografica possa variare in rapporto all’anomalia indagata e all’epoca di gravidanza in cui l’esame viene svolto.

In tutti gli studi la sensibilità ecografica risulta del 68.3-100% per quanto riguarda le anomalie del SNC e del 64.1%-100% per l’apparato genito-urinario. È invece molto più bassa per le cardiopatie congenite (16.5%-66.6%) e le anomalie scheletriche (8.2%-67.8%)(6).

Bisogna quindi tenere presente che quando viene eseguita un’ecografia senza indicazioni specifiche, cioè in donne che non hanno rischi particolari di difetti congeniti, almeno il 30% delle malformazioni fetali potenzialmente diagnosticabili non viene riconosciuto, potendo così creare delle false rassicurazioni sulla salute del nascituro. Questo dato contrasta con quelle che sono normalmente le aspettative riguardo all’ecografia, e raramente viene spiegato quando si propone un controllo ecografico in gravidanza. L’accuratezza dell’indagine ecografica, in ogni caso, aumenta con l’aumentare dell’epoca gestazionale, indipendentemente dall’esperienza dell’operatore, dal modello di ecografo utilizzato e dal tipo di anomalia. Sempre più spesso, in occasione del riscontro ecografico di malformazione fetale, l’equipe del centro di diagnosi prenatale, discute collegialmente la diagnosi ecografica, le sue implicazioni e le conseguenze per la qualità di vita del nascituro. In questo ambito il medico genetista, quando convocato, deve collaborare alla costruzione di un percorso di approfondimento diagnostico, proposta di test genetici, identificazione delle diagnosi differenziali. È inoltre sua responsabilità condurre un’anamnesi familiare esaustiva, mirata con gli strumenti specifici del colloquio di consulenza genetica.

Il riconoscimento di una malformazione maggiore, a carico di un qualsiasi organo fetale, costituisce il punto di partenza da cui tentare una conoscenza più completa della situazione fetale. Si può affermare che, in linea generale, non meno del 10% dei soggetti che presenta una malformazione rilevata mediante l’ecografia, associa altri difetti congeniti. Appare pertanto cruciale, per definire la prognosi ed informare correttamente i genitori, accertarsi che la coppia possa usufruire delle tecniche di diagnosi (ad esempio esecuzione del cariotipo) e di approfondimento della morfologia (ecografia 2-D e 3-D, ecocardiografia fetale)(11). È infine importante che la donna comprenda che la vita intrauterina del bambino è un continuo divenire e che l’immagine ecografica coglie solo un momento delle modificazioni dinamiche che accompagnano lo sviluppo fetale. Un rilievo ecografico può evolvere, ma anche essere transitorio ed andare incontro a regressione spontanea: sarà quindi compito del medico fornire alla donna tutte le informazioni necessarie alla valutazione del rischio e del suo significato, senza creare inutili allarmismi.

Nei casi di interruzione della gravidanza deve essere garantito un percorso di verifica diagnostica ed approfondimento. In particolare è necessario che il feto sia sottoposto ad indagine radiologica ed esame anatomopatologico. Il patologo ha il dovere di provvedere ad accantonare materiale fetale (campione di cellule o tessuto) nel caso questo non sia stato eseguito in precedenza. Questo materiale può essere di inestimabile valore quando venga generata un’ipotesi diagnostica e si desideri la conferma mediante test genetico. Spesso la definizione del rischio di ricorrenza, la possibilità di sorvegliare una successiva gravidanza e la consulenza ai familiari della coppia, dipende proprio da questa risorsa.

LINEE GUIDA PER GLI SCREENING ECOGRAFICI IN OSTETRICIA

In generale, si intendono per linee guida una serie di raccomandazioni di comportamento clinico, prodotte attraverso un processo sistematico, allo scopo di assistere medici e pazienti nel decidere quali siano le modalità di assistenza più appropriate in specifiche circostanze cliniche.

Gli obiettivi delle linee guida sono:

• miglioramento dello stato di salute della comunità,

• miglioramento dei comportamenti assistenziali,

• ottimizzazione delle prestazioni sanitarie sotto il profilo del rapporto costo/beneficio,

• formazione permanente del medico,

• probabile maggior tutela del medico in caso di contenzioso medico-legale.

In considerazione di quanto detto la Società Italiana di Ecografia Ostetrico-Ginecologica (SIEOG, 1996)(12) ha elaborato le linee guida per gli screening ecografici. È evidente che gli standard e le linee guida sono differenti a seconda delle finalità dell’esame ecografico ostetrico e che queste cambiano in rapporto all’epoca di gravidanza (Tab. 2).

Finalità dell’ecografia nel I trimestre

- dimostrazione dell’impianto della camera gestazionale in sede normale

- dimostrazione della presenza, vitalità e numero degli embrioni

- datazione della gravidanza

Nel II trimestre (preferibilmente tra la 18^a e le 22^a settimana)

- valutazione dell’eco-anatomia fetale (screening delle malformazioni)

- valutazione della biometria fetale

Nel III trimestre (preferibilmente tra la 30^a e la 34^a settimana)

- individuazione dei ritardi di crescita

- individuazione delle malformazioni non rilevabili nel il trimestre

- localizzazione della placenta

- valutazione del liquido amniotico

Tab. 2

L’ecografia come tecnica di supporto

in questo ambito la tecnica ecografica risulta cruciale per:

•    corretta datazione della gravidanza,

•    guida delle procedure di prelievo nel i e ii trimestre,

•    identificazione di segni secondari (variazione del liquido amniotico, movimenti fetali, biometria fetale ecc.).

LE TECNICHE DI PRELIEVO DI CELLULE FETALI

L’amniocentesi è stata la prima ed è la più comune tecnica di prelievo di tessuti fetali. Consiste nel prelievo di liquido amniotico (LA) mediante ago da spinale monouso (20G) introdotto per via transaddominale sotto controllo ecografico continuo. È una metodica che viene eseguita ambulatoriamente e non richiede precauzioni particolari prima o dopo il prelievo. L’amniocentesi si esegue tradizionalmente oltre la 15^a settimana di gravidanza, cioè dalla 15^a alla 19^a settimana, sebbene tecnicamente possa essere eseguita anche successivamente. In 15^a e 17^a settimana la quantità di LA è valutata mediamente intorno a 200 ml di cui se ne prelevano circa 20.

Il prelievo di liquido amniotico deve sempre essere preceduto da un’accurata indagine ecografica utile ai fini del prelievo stesso ma anche alla valutazione dell’anatomia fetale.

L’unica impossibilità all’esecuzione dell’amniocentesi è rappresentata dalla condizione di anidramnios; in questo caso può essere necessario procedere ad una villocentesi tardiva.

Complicanze

Numerosissimi sono gli studi effettuati per verificare la sicurezza dell’amniocentesi e gli esiti feto-neonatali (13,14,15). Essi definiscono l’amniocentesi come una procedura sicura, caratterizzata da una bassa percentuale di complicanze che sono così riassunte:

- perdita fetale con una probabilità dello 0,5%, da sommarsi al rischio di aborto spontaneo dopo la 16^a settimana (0.7-1%). Attualmente il rischio di cicatrici fetali conseguenti a lesioni prodotte dall’ago è estremamente basso;

- modiche perdite di liquido amniotico sono frequenti ma spesso transitorie e di poco significato clinico;

- alloimmunizzazione Rh: in pazienti Rh negative, non sensibilizzate, con partner Rh positivo, è necessario somministrare globuline anti-D subito dopo la procedura.

Alcune situazioni, quali la contaminazione batterica o l’inquinamento ematico massivo, possono determinare fallimento della coltura cellulare e costituiscono motivo di ripetizione dell’esame.

Cellule fetali utili all'analisi citogenetica e molecolare

Le cellule fetali presenti nel liquido amniotico hanno origine sia dai tessuti fetali che dagli annessi. Devono essere di regola coltivate per 10-15 giorni affinché possa essere condotta l’analisi cromosomica o le analisi biochimiche o anche nel caso sia necessario ottenere un quantitativo di DNA sufficiente per specifiche indagini molecolari. Esse risultano comunque ottimali per l’indagine citogenetica standard (identificazioni delle alterazioni numeriche e di struttura dei cromosomi) e per le tecniche di citogenetica molecolare mediante FISH (identificazione di piccoli riarrangiamenti, delezioni, marcatori di piccole dimensioni).

L’accuratezza diagnostica è molto elevata con falsi positivi e falsi negativi nettamente al di sotto dello 0.5%. Come per tutti i tessuti fetali va sempre considerata la possibilità di contaminazione materna.

Il prelievo dei villi coriali

La villocentesi, entrata nella pratica clinica nel 1984-85, ha costituito un grande avanzamento per la diagnosi prenatale delle malattie geniche sia per l’epoca precoce di esecuzione sia per la possibilità di ottenere, mediante il prelievo, diversi milligrammi di tessuto fetale.

La villocentesi consiste in pratica nel prelievo di un campione di tessuto trofoblastico (placenta) mediante un ago da spinale (20G) per via transaddominale sotto controllo ecografico continuo. Si esegue prevalentemente tra la 10^a e la 12^a settimana, ma può essere eseguita anche nel secondo o terzo trimestre di gravidanza, quando sia difficile o impossibile prelevare liquido amniotico o sangue fetale, oppure in caso di pazienti giunte tardi alla diagnosi prenatale.

L’esecuzione del prelievo dei villi coriali richiede una valutazione immediata della quantità e della qualità del materiale prelevato. La quantità del materiale da prelevare può essere diversa in base agli esami ed alle necessità dei rispettivi laboratori (citogenetica, analisi enzimatica, analisi del DNA).

In circostanze molto rare il prelievo di villi coriali non può essere eseguito (retroversione spiccata dell’utero, perdite ematiche ricorrenti e recenti). in questi casi si attende un’epoca successiva ed eventualmente si ricorre all’amniocentesi.

Il prelievo di villi coriali è la tecnica di elezione per la diagnosi prenatale delle malattie geniche. il DNA estratto dal trofoblasto può infatti essere rapidamente utilizzato per indagini dirette (ricerca di mutazioni) o di linkage.

Complicanze

- Perdita fetale. Il rischio di perdita fetale relativo alla tecnica di prelievo dei villi coriali, eseguita da operatori esperti ed in centri di ii livello, non si discosta significativamente da quello legato all’ amniocentesi. Ciò nonostante esiste un rischio maggiore di aborto spontaneo (3-5%) per la precocità di esecuzione dell’ esame. Pertanto la probabilità totale di aborto è maggiore dopo villocentesi.

- Ipogenesia oromandibolare e difetti traversi degli arti, sono stati segnalati in letteratura nell’ambito delle complicanze in neonati di madri sottoposte a prelievo di villi coriali nelle fasi precoci di gravidanza (6-8 s.g.). È quindi sconsigliato effettuare il prelievo prima della 10^a settimana prima cioè che siano terminati i processi di embriogenesi.

- Episodi di spotting si possono verificare dopo il prelievo e raramente rappresentano un vero segnale di allarme.

- Alloimmunizzazione Rh in pazienti Rh negative. Le indicazioni alla profilassi sono le medesime date per l’amniocentesi.

Cellule fetali utili per la diagnosi prenatale: le cellule che formano i villi coriali sono di due tipi: citotrofoblasto (parte esterna del villo) e cellule del mesenchima (parte interna del villo).

Il citotrofoblasto ha la caratteristica di avere cellule in mitosi spontanea che vengono utilizzate per le indagini citogenetiche con il metodo “diretto” o della “coltura a breve termine”. Le cellule del mesenchima vengono di regola utilizzate per generare colture di villi utili ad eseguire l’analisi cromosomica dopo coltura a lungo termine. L’utilizzo contemporaneo delle due metodiche riduce ad un livello minimo i falsi positivi ed i falsi negativi che complessivamente sono circa l’1-2%.

Sebbene i villi coriali costituiscano la fonte ottimale di DNA, possono contenere cellule materne derivate dalla decidua che, se non riconosciute ed isolate mediante osservazione al microscopio invertito, possono essere alla base di errori diagnostici a causa di contaminazione materna.

La funicolocentesi o prelievo di sangue fetale

Si effettua in centri di II livello e consiste in un prelievo di sangue funicolare eseguito mediante ago introdotto per via transaddominale sotto guida ecografica continua. Permette il prelievo di sangue fetale puro a partire dalla 20^a settimana di gravidanza fino al termi-ne(16).

Può essere effettuata all’inserzione placentare del funicolo o all’emergenza addominale per via intraepatica.

La funicolocentesi trovava ampia applicazione nella diagnosi prenatale di alcune malattie geniche, in particolare la talassemia ed i deficit immunitari congeniti, prima dell’avvento delle tecniche di analisi del DNA. Attualmente le indicazioni al prelievo di sangue fetale sono prevalentemente correlate ad indagini citogenetiche urgenti, ad esempio dopo il riscontro (Toxoplasmosi, Rosolia, Citomegalovirus, Varicella, Parvavirus) di malformazioni fetali, oppure ad indagini sul benessere fetale per sospette infezioni fetali, gravi ritardi di crescita, disturbi metabolici.

Complicanze

Le complicanze materne dopo funicolocentesi sono rare, principalmente dovute a perdite di liquido amniotico o sangue nello 0,2% dei casi; generalmente sono transitorie e risolvibili con terapia tocolitica. La corion-amniosite invece è una complicanza grave sia per la madre che per il feto (0,27%). L’isoimmunizzazione Rh è una complicazione teoricamente possibile a causa di un’emorragia feto-materna; si può prevenire somministrando 300 mcg. di immu-noglobuline anti-D, controllando test di Coombs indiretto ed eseguendo il Kleihauer.

Per quanto riguarda le complicazioni fetali è necessario premettere che il rischio di perdita fetale dopo funicolocentesi dipende da numerosi fattori tra cui l’indicazione al prelievo, l’epoca gestazionale in cui è stato eseguito, la durata del prelievo, il numero di inserzioni dell’ago e soprattutto l’esperienza dell’operatore.

Un transitorio sanguinamento si può verificare nel punto di inserzione dell’ago; mentre una bradicardia può essere conseguente a riflesso dopo puntura dell’arteria ombelicale, ma può essere causata, se persistente, da lacerazione dei vasi funicolari o da ematoma del funicolo. La perdita fetale complessiva si verifica nel 2-3% dei casi.

Cellule fetali utili per la diagnosi prenatale

In generale, per l’esame cromosomico e per lo studio molecolare vengono utilizzati i linfociti fetali. Nel primo caso si usano metodi colturali analoghi a quelli in uso per il cariotipo eseguito in epoca post-natale sul sangue periferico. Nel secondo caso si procede all’estrazione del DNA con micrometodi. L’attendibilità diagnostica, in assenza di contaminazione materna (molto meno frequente di una volta per l’approccio intraepatico) è molto elevata.

Biopsie fetali

Si tratta di procedure con indicazioni molto limitate ed eseguite in pochissimi centri. La tecnica prevede l’uso di pinze ed ago, per via transaddominale, sotto controllo ecografico continuo. Il rischio di complicanze è simile a quello della funicolocentesi.

Fetoscopia

Eseguita solo in pochissimi Centri trova indicazione in rari casi in cui sia necessaria la valutazione della morfologia di distretti poco visibili con l’ecografia (volto, estremità ecc). Il miglioramento delle tecniche ecografiche ha portato ad un restringimento delle indicazioni. Il rischio delle complicanze è simile a quello della funicolocentesi.

Quale tecnica utilizzare?

La scelta della procedura ostetrica di prelievo di cellule fetali è il risultato di una serie di considerazioni e circostanze che devono guidare il medico e la paziente, all’interno di un rapporto di fiducia, alla scelta “ottimale”.

In linea di massima è possibile affermare che:

- La villocentesi è da utilizzare in modo praticamente esclusivo per tutte le indicazioni di diagnosi prenatale di malattie geniche, indagabili con tecniche molecolari o biochimiche. In questi casi è possibile abbinare l’analisi del cariotipo fetale, considerando che il quantitativo di villi necessario non è inferiore ai 15mg.

- È giusto prospettare la villocentesi alle coppie che affrontano un rischio di anomalie fetali superiore al 5% come avviene per esempio per i portatori di anomalie cromosomiche bilanciate, oppure per età materna avanzata, superiore ai 40 anni.

- La villocentesi, consentendo di offrire una eventuale interruzione della gravidanza in un’epoca molto più precoce rispetto a quella prevista dopo l’amniocentesi, è in genere richiesta dalle coppie che hanno sperimentato una pregressa gravidanza patologica ed eventualmente un aborto volontario nel ii trimestre.

- Per le coppie con rischi di anomalie cromosomiche solo lievemente superiori a quelli della popolazione generale è senza dubbio consigliabile l’amniocentesi che è una tecnica molto diffusa, praticata in tantissimi centri, di facile esecuzione e con elevatissima affidabilità diagnostica, soprattutto per una bassa percentuale di falsi positivi rispetto alla villocentesi.

La nostra opinione è che, comunque, la valutazione dei vantaggi o svantaggi della procedura del I e del II trimestre debba essere condivisa dalla donna/coppia alla luce delle opinioni personali, aspettative riguardo la diagnosi prenatale e percezione (anche soggettiva) del proprio rischio riproduttivo.

La tabella 3 riassume le caratteristiche delle procedure ostetriche tradizionali di diagnosi prenatale.

I possibili esiti patologici dell'analisi citogenetica prenatale in riferimento alla diagnosi di SD

Trisomia 21 primaria,

Si tratta dell’esito più frequente. Viene indicato con la seguente formula cromosomica (v. cap. 2):

47.XX,+21 nel caso di soggetto di sesso femminile 

47,XY,+21 nel caso di soggetto di sesso maschile

Tab. 3

Trisomia 21 secondaria.

È conseguente ad una traslocazione di un cromosoma 21 su un cromosoma acrocentrico (13; 14;15 o il 21 stesso). Viene indicato con la seguente formula cromosomica (v. cap. 2): 

46,XX,t(14;21)(q10;q10) nel caso di soggetto femminile 

46,XY,t(14;21)(q10;q10) nel caso di soggetto maschile.

Mosaicismo cromosomico

Con il termine di mosaicismo cromosomico si intende la presenza nello stesso organo, nello stesso tessuto o nello stesso individuo, di due linee cellulari che si differenziano sulla base del cariotipo. Il mosaicismo si realizza con due meccanismi principali: correzione di un concepimento trisomico (“trisomic rescue”) oppure per un errore mitotico. In entrambi i casi l’evento avviene nelle primissime fasi dello sviluppo embriologico ed è frutto di un errore occasionale, non ereditario. Le conseguenze cliniche del mosaicismo sono variabili ed in parte dipendenti dalla percentuale di cellule con l’alterazione citogenetica e dalla distribuzione della linea patologica nei diversi tessuti fetali.

Il riscontro di un mosaicismo per la presenza di una linea cellulare con trisomia 21 in diagnosi prenatale costituisce sempre una fonte di allarme e di dilemma interpretativo. In

linea generale si puo’ affermare che il riscontro del mosaicismo nel primo trimestre, nell’ambito delle cellule derivate dai villi coriali, rende indicata l’esecuzione di un secondo prelievo, specificamente l’amniocentesi per la ripetizione del cariotipo su un tessuto fetale di diversa origine embrionaria. Nei casi di riscontro di mosaicismo su cellule del liquido amniotico è importante prospettare alla coppia di genitori un controllo ulteriore, mediante la funicolo-centesi, sulle cellule del sangue fetale.

in tutti i casi il punto di partenza resta la percentuale delle cellule trisomiche rispetto a quelle normali il cui valore serve per orientare la consulenza alla coppia. Il mosaicismo placentare si riscontra in circa 1 caso ogni 50 campioni di villi coriali. Il mosaicimo su amniociti si riscontra in circa 1 caso ogni 300 campioni di liquido amniotico. Il mosaicismo su linfociti e, in definitiva alla nascita, si riscontra molto più raramente, circa in un soggetto ogni 2000.

NUOVE TECNICHE DI DIAGNOSI PRENATALE

La PCR fluorescente (QF PCR) si è affiancata alle tecniche citogenetiche tradizionali come ausilio diagnostico rapido e mirato delle più importanti aneuploidie fetali (cromosomi 21, 13, 18, X e Y), in sostituzione della tecnica di ibridizzazione fluorescente in situ (FISH)(17,18,19). La metodica è basata sull’amplificazione fluorescente (QF-PCR) di sequenze di DNA ripetute altamente polimorfiche (Short Tandem Repeat - STR) localizzate sui cromosomi oggetto di studio e successiva elettroforesi capillare. La QF-PCR, eseguita su DNA estratto da cellule del liquido amniotico, villi coriali e sangue fetale, permette di definire l’assetto numerico dei cromosomi presi in considerazione.

L’elettroforesi capillare viene eseguita mediante sequenziatore automatico a tecnologia fluorescente, a seguito della quale per ciascun prodotto di PCR vengono calcolate le dimensioni, l’altezza e l’area di ciascun picco fluorescente. La verifica in termini qualitativi e quantitativi della segregazione degli alleli parentali permette di evidenziare nel feto la presenza di eventuali trisomie.

I tracciati che si ottengono, per ogni STR, in caso di un assetto cromosomico normale sono 2 picchi di uguale area ed altezza. in caso di trisomia si possono verificare 2 differenti situazioni: presenza di 3 picchi per la trisomia triallelica o 2 picchi con rapporto aree 1:2 per la trisomia diallelica (Fig. 1). Per quanto riguarda i cromosomi sessuali viene impiegata una sequenza relativa al gene dell’amelogenina. In questo caso un amplificato con un solo picco indica un assetto cromosomico femminile (XX), mentre uno con 2 picchi di differente dimensione un assetto maschile (XY). L’impiego di più marcatori con un alto indice di etero-zigosità per ciascun cromosoma porta ad una frequenza molto bassa del pattern allelico non informativo (unico picco) per tutti i loci investigati.

La valutazione molecolare delle aneuploidie rappresenta un utile supporto diagnostico nei casi di fallimento della coltura cellulare, referti ecografici dubbi in gravidanze inoltrate, riscontro immediato di sindromi polimalformative (es. triplodie), conferma di ITG per triso-

mie 13, 18, e 21. Inoltre, i costi analitici contenuti della procedura permettono di offrire ai pazienti un test diagnostico affidabile come la FISH, ma rispetto a quest’ultima molto meno costoso e, soprattutto, completamente automatizzato.

La diagnosi genetica preimpianto

È stata realizzata per la prima volta con successo nel 1990 da Handyside e coll. per la determinazione del sesso embrionario per coppie a rischio di malattie legate alla X. Da allora la diagnosi genetica preimpianto è stata utilizzata per un numero ancora limitato di pazienti con tecnologie diverse nei diversi centri. Nella maggior parte dei casi è stata comunque realizzata attraverso una biopsia dello zigote allo stadio di 6-10 cellule. Una o due cellule, rimosse con tecniche di micromanipolazione vengono utilizzate per l’indagine genetica mediante PCR o FISH. Un numero variabile di embrioni non affetti (massimo 2, secondo i più recenti orientamenti) vengono poi inseriti nella cavità uterina sperando in un impianto regolare.

Nei lavori che analizzano l’uso della diagnosi preimpianto, è stato riportato che due terzi dei pazienti hanno ricevuto una diagnosi per anomalie cromosomiche mentre solo un terzo si è sottoposto ad indagini per malattie geniche (Fibrosi cistica, Distrofia muscolare Duchenne, PTalassemia, Malattia di Tay-Sachs, Immunodeficienza Severa Combinata).

Gli studi compiuti finora non hanno dimostrato un incremento del numero di anomalie congenite dopo l’uso della diagnosi preimpianto. Bisogna però sottolineare che non sono ancora chiariti i limiti e i rischi di errore della tecnica (falsi negativi sono stati riportati prima dell’utilizzo della tecnica ICSI, a causa di contaminazione con spermatozoi o altre fonti di DNA). Certamente la percentuale di gravidanze che si ottengono in pazienti fertili, usando tecniche di fecondazione assistita è molto più bassa di quella che si avrebbe attraverso la fecondazione naturale. È importante quindi che la prospettiva di questo tipo di diagnosi venga sempre accompagnata da una consulenza rigorosa e completa che analizzi le motivazioni personali, le indicazioni e le aspettative della coppia nei confronti della diagnosi genetica preimpianto.

Cellule fetali o DNA fetale nel sangue materno

È stato per decenni un desiderio dei clinici coinvolti nella diagnosi prenatale quello di offrire tecniche non invasive che fossero utilizzate da tutte le gestanti a prescindere dal loro rischio riproduttivo e dal loro orientamento nei confronti dell’interruzione della gravidanza.

Fin dal 1969 era stato documentato che linfociti fetali circolavano nel sangue materno, ma la separazione e concentrazione di un numero sufficiente di tali cellule ha presentato problemi tecnici quasi insormontabili.

Lo sviluppo recente di tecniche di “cell sorting” e di amplificazione genica ha dato nuovo impulso alle ricerche consentendo ad esempio di individuare il tipo di cellule fetali più adeguato per l’analisi. I linfociti fetali, infatti, come anche le cellule del citotrofoblasto, già da tempo dimostrate nel sangue materno, permangono a lungo nell’organismo della madre e un loro reperimento può riferirsi a gravidanze precedenti. Dal 1994 diversi lavori hanno dimostrato una fattibilità di diagnosi soprattutto per le aneuploidie cromosomiche(20).

Si è però ancora lontani da una concreta possibilità di diagnosi che si mostri sufficientemente riproducibile e praticabile in un numero ampio di centri. È indubbio che questo ambito della diagnosi prenatale venga visto tra i più promettenti e ambiziosi.

Screening per anomalie cromosomiche

Test di screening

Si tratta di indagini eseguite per definire una probabilità “personalizzata” che l’embrione sia affetto dalla sD e, in misura minore, da altre anomalie cromosomiche o da difetti del tubo neurale se si prende in considerazione la sola alfa-feto proteina.

Esistono due metodi consolidati: il metodo biochimico, duo-test o in misura molto minore il triplo test ed il metodo ecografico, o misurazione della translucenza nucale (TN) (Fig. 2)(21).

Il duo test, si esegue sul siero materno intorno alla 11^a -12^a settimana di gestazione, valutando i valori di due analiti (la frazione beta libera della Coriogonadotropina Umana (HCG) e la PAPP-A cioè la Proteina Associata alla Gravidanza) che vengono computati con altri parametri materni (età, peso, presenza meno di diabete, fumo, ecc.).

Qualora la probabilità ottenuta superi un valore soglia, in genere quello corrispondente al rischio delle donne di 35 anni, viene indicata la diagnosi prenatale citogenetica. Generalmente il duo-test viene associato alla misurazione della TN e la valutazione della probabilità individualizzata è formulata sulla base di entrambi i parametri.

La misurazione della TN, che consiste nella valutazione dello spessore della regione retro-nucale come rappresentato nella figura 1, si effettua tra l’11^a e la 14^a settimana e consente anch’essa di ottenere una probabilità personalizzata di feto affetto da anomalie cromosomiche. Ad un valore di falsi positivi del 6-9% la capacità del test di individuare feti affetti da anomalie cromosomiche è dell’80%.

La positività del test della TN, in presenza di un cariotipo fetale nella norma, non consente però di annullare la probabilità di patologie fetali che possono riguardare il cuore (cardiopatie congenite nel 3-5% dei casi) l’apparato scheletrico, alcune malformazioni viscerali quali l’ernia diaframmatica. Nei casi in cui la TN sia stata “allarmante” è quindi indicato, oltre il cariotipo, eseguire in epoche successive della gravidanza, una valutazione morfologica fetale e un’ecocardiografia fetale. Anche a fronte di una negatività di questi successivi accertamenti è prudente considerare un rischio residuo di anomalie congenite lievemente superiore a quello della popolazione generale (5%).

I destinatari “ottimali” dello screening mediante TN e duo test sono le donne di età inferiore ai 35 anni, che non sono candidate in prima istanza alla diagnosi prenatale invasiva, e permette di identificare circa il 70-80% delle gravidanze con feto affetto, con una percentuale di falsi positivi, cioè di procedure “inutili” di circa il 5-6%.

Data la peculiarità del risultato dello screening, che a differenza di altri esami non dà una certezza di feto affetto o non affetto, è doveroso che la gestante venga informata preventivamente circa il tipo di esame, i vantaggi e le conseguenze che questo può comportare in modo che possa scegliere in modo informato se effettuare o meno l’indagine.

L’informazione, che è a cura del ginecologo curante, deve includere che:

- in caso di risultato a rischio “aumentato”: questo non significa che il feto sia affetto, occorrerà eseguire ulteriori accertamenti diagnostici se si vuole confermare con certezza la presenza di un feto patologico,

- gli eventuali iter diagnostici da affrontare in caso di risultato “allarmante” riguardano procedure invasive delle quali vanno chiariti benefici e rischi; in questo caso alla gestante va garantita la possibilità di sottoporsi ad ulteriori accertamenti diagnostici nella struttura pubblica (D.M. 10.9.98) a meno che decida di rivolgersi volontariamente ad una struttura privata,

- il test di screening è mirato alle anomalie cromosomiche, non può dare indicazioni su altre alterazioni genetiche, quali ad esempio le malformazioni o le malattie ereditarie.

Lo screening è, per definizione, un esame volontario e deve essere collegato all’espressione di un consenso informato.

I valori ottenuti in un’epoca compresa tra l’8^a e la 12^a settimana di gestazione, computati con l’età materna, consentono di formulare una probabilità di feto affetto con una specificità e sensibilità superiore a quelle descritte per il triplo test (4,22,23,24).

È importante sottolineare il ruolo della corretta informazione pre-test e successiva al test per evitare aspettative irrealistiche nei confronti dello screening che sono alla base delle gravi conseguenze psicologiche legate alla nascita di un bambino con SD dopo screening fetale rassicurante (25).

Ruolo del medico genetista nell'ambito dell'equipe della diagnosi prenatale

Nel corso degli ultimi dieci anni la figura del medico genetista ha acquisito maggiore rilevanza all’interno dell’equipe di diagnosi prenatale. Il suo ruolo è articolato e può essere schematizzato nei seguenti punti, sebbene ogni realtà possa di fatto differenziarsi per circostanze, priorità di intervento, tipologia di casi seguiti ecc.

• Intervento al momento della programmazione della diagnosi prenatale (verifica dell’ indicazione, fattibilità, raccordo con servizio di laboratorio, definizione del percorso).

• Commento ed interpretazione egli esiti dei test genetici o delle indagini ecografiche,

• Intervento nella valutazione del rischio riproduttivo dopo una gravidanza patologica esitata in interruzione volontaria o nella nascita del bambino.

La comunicazione e l'assistenza alle scelte

Il percorso della diagnosi prenatale non dovrebbe mai essere svincolato dalla possibilità, per la donna e la coppia, di compiere scelte consapevoli, incluso considerare l’opzione di interruzione della gravidanza nei casi di diagnosi di grave patologia fetale. Bisogna sottolineare che la richiesta di diagnosi prenatale è sempre e in ogni caso un atto volontario e può essere avanzata da chiunque, anche in assenza di uno specifico incremento del rischio fetale.

La regolamentazione dell’accesso ai servizi di diagnosi prenatali, voluta dal Ministero della Sanità con il decreto DM 10 settembre 1998 (26) riflette precise scelte di politica socio-sanitaria che riguardano da un lato le risorse economiche che si è deciso di destinare a questi servizi e dall’altro un bilancio tra i rischi delle procedure di indagine e la probabilità di identificare feti affetti. Esiste però un rischio naturale, che riguarda tutte le gestanti e che non è legato a fattori identificabili in base all’anamnesi. Quando la richiesta di indagini viene posta dalla donna/coppia sulla base delle informazioni possedute riguardo il loro rischio e le tecniche disponibili per identificare anomalie fetali, è cruciale che la consulenza sia condotta in modo obiettivo, completo e con il preciso scopo di assistere la donna nel valutare i pro ed i contro dell’uso della diagnosi prenatale.

L’induzione di indagini prenatali senza i requisiti di conoscenza della patologia e in presenza di rischi estremamente bassi, rappresenta una responsabilità professionale molto forte che bisogna saper riconoscere, vista la situazione di “fragilità emotiva” che caratterizza la donna in gravidanza e vista la generale ansietà che accompagna oggi il percorso di scelta della donna in età riproduttiva.

La nostra esperienza infine ha confermato negli anni quale sia la rilevanza del lavoro multidisciplinare in questo ambito. Un lavoro di equipe che possa veramente integrare le competenze per assistere al meglio la donna e la coppia nel difficile percorso di scelta che precede e segue la diagnosi prenatale. Tra gli elementi determinanti riteniamo debba essere considerato l’aspetto psicologico ed emotivo che affianca gli aspetti clinici rendendo spesso impossibile percepire questi ultimi se non nel rispetto dei primi.

Ogni scelta che implichi decisioni di fare o non fare, di proseguire o interrompere, di accettare o rifiutare tocca in modo profondo ed unico l’intero essere e richiede un’attenzione senza eguali da parte dei medici che scelgono di lavorare nei servizi di diagnosi prenatale. Questi servizi devono offrire tutte le procedure disponibili, tutti gli accertamenti diagnostici praticabili ma soprattutto devono saper assistere la donna/coppia nei casi di scelta di interruzione della gravidanza così come nei casi di prosecuzione.

Qualunque aspetto sia praticato al di sotto degli standard ottimali di cura, compresa l’informazione e il sostegno, rappresenta una responsabilità con la quale è necessario confrontarsi.

BIBLIOGRAFIA

1. Harper P.Ss, Practical Genetic Counselling, Butterworth Heinemann, Oxford 1998

2. Chaoui R., Prenatal ultrasound diagnosis of Down syndrome. After major malformations, soft markers, nuchal translucency and skeletal signs, a new vascular sign? Ultrasound Obstet, Gynecol. 2005 Sep;26(3):214-7.

3. Ogilvie C.M., Lashwood A., Chitty L., el al., The future of prenatal diagnosis: rapid testing or full karyotype? An audit of chromosome abnormalities and pregnancy outcomes for women referred for Down’s Syndrome testing, BJOG. 2005 Oct;112(10):1369-75

4. Muller P.R., Cocciolone R., Haan E.A., et al., Trends in state/population-basedDown syndrome screening and invasive prenatal testing with the introduction of first-trimester combined Down syndrome screening, South Australia, 1995-2005. Am J Obstet Gynecol. 2007, 196(4), 1-7; 285-6, 315.

5. Comitato Nazionale di bioetica, Istituto Superiore di Sanità. Diagnosi prenatale, 1999

6. Stoll C., Alembik Y., Dott B., et al., Impact of prenatal diagnosis on livebirth prevalence of children with congenital anomalies. Ann Genet. 2002 Jul-Sep; 45(3):115-21.

7. Milunsky A., Genetic Disorders and the fetus. Diagnosis, Prevention and Treatment. Forth Ed The Johns Hopkins University Press. 1998.

8. Chitty L.S., Ultrasound screening for fetal abnormalities. Prenat Diagn. 1995;15:1241-57.

9. Stoll C, Dott B., Alembik Y., et al., Evaluation of routine prenatal diagnosis by a registry of congenital anomalies. Prenat Diagn. 1995;15:791-800.

10. Levi S., Hyjazi Y., Schaapst J.P., et al., Sensitivity and specificity of routine antenatal screening for congenital anomalies by ultrasound: the Belgian Multicentric Study. Ultrasound Obstet Gynecol. 1991;1:102-10.

11. Rustico M.A., Lalatta F., Righini A., et al., The role of integrated imaging techniques for prenatal prediction of phenotype in two cases of facial anomalies. Prenat Diagn. 2004;24:508-12.

12. SIEOG. Linee guida per gli screening ecografici in ostetricia e ginecologia. Roma: CIC edizioni Internazionali, 1996.

13. NICHHD National Registry for Amniocentesis study Group: Midtrimester amniocentesis for prenatal diagnosis: safety and accuracy. JAMA 236:1471,1976

14. Canadian Collaborative CVS-Amniocentesis Clinical TrialGroup: Multicentre Randomized clinical trial of chorionic villus sampling and amniocentesis Lancet 1:1 1989

15. Sundberg K.,Bang J.,Smith-Jensen S., et al., Randomized study of risk of fetal loss related to early amniocentesis versus chorionic villus sampling, Lancet 1997, 350(9079): 697-703.

16. Daffos F.,Capella-Povolsky M., Frestier F., Fetal blood sampling during pregnancy with use of a needle guided ultrasound a study of 606 consecutive cases. Am J Ostet Gynecol 1985, 153:665

17. Cirigliano V., Ejarque M., Canadas M.P., et al., Clinical application of multiplex quantitative fluorescent polymerase chain reaction (QF-PCR) for the rapid prenatal detection of common chromosome aneuploidies. Mol Hum Reprod. 2001, 7:1001-1006.

18. Adinolfi M, Sherlock J., Prenatal detection of chromosome disorders by QF-PCR. Lancet 2001; 358:1030-1031

19. Nicolini U., Lalatta F., Natacci F., et al., The introduction of QF-PCR in prenatal diagnosis of fetal aneuploidies: time for reconsideration. Hum Reprod Update. 2004 Nov-Dec;10(6):541-8.

20. Simpson JL., Elias S., Isolating fetal cells in maternal circulation for prenatal diagnosis. Prenat Diagn 1994, 14:1229-1242.

21. Nicholaides K.H., Brizot M.L., Snijders R.J.M., Fetal nuchal translucency, ultrasound screening for fetal trisomy in the first trimester of pregnancy. Br J Obstet Gynecol 1994, 101: 782786.

22. Spencer K., Aneuploidy screening in the first trimester. Am J Med Genet C Semin Med Genet. 2007 Feb 15;145(1):18-32.

23. Gidiri M., McFarlane J., Holding S., et al., Maternal serum screening for Down syndrome: are women’s perceptions changing? BJOG. 2007 Apr;114(4):458-61.

24. Gidiri M., McFarlane J., Holding S., et al., Uptake of invasive testing following a positive triple test for Downs syndrome. Are midwives different counsellors compared with obstetricians? J Obstet Gynaecol. 2007 Feb;27(2):148-9.

25. Marteau T.M., Prenatal testing: toward realistic expectation of patients, providers and policy makers. Ultrasound Obstet Gynecol. 2002, 19:5-6, 202

26. Decreto DM 10 settembre 1998 (aggiornamento del d.m. 6 marzo 1995). Gazzetta Ufficiale 20 ottobre 1998, n. 245.

BIBLIOGRAFIA DI APPROFONDIMENTO

- Bishop C.E., DNA-based prenatal diagnosis. In Simpson JL. Elias S: Editors Essentials of prenatal diagnosis New York Churchill Livingstone, 1993.

- Chervenak F.A., McCullough L.B., Ethical implications for early pregnancy of the fetus as a patient: a basic ethical concept in fetal medicine. Early pregnancy 1995, 1(4):253-257.

- Cheung M.C., Goldberg J.D., Kann Y.W., Prenatal diagnosis of sickle cells in maternal blood. Nat Genet 1996,14:264-268.

- Dallapiccola B., Novelli G., Genetic Testing and prenatal diagnosis. Minerva Biotecnologica 2000, 12/1:5-14.

- Gates E.A., Prenatal genetic testing: does it benefit pregnant women? In Rothenberg KH, Thomson EJ editors. Women and prenatal testing, the challenges of genetic technology Columbus, Ohio State University Press, 1994.

- Kessler S. Psychological aspects of genetic counselling. VII Thoughts on directiveness J Genet Counsel 1992, 1(1):9-17.

- Lo YMD, Hjemlm NM.,Fidler C. et al., Prenatal diagnosis of fetal RhD status by molecular analy-sis of maternalplasma. N Engl J Med 1998, 339(24): 1734-1738.

- Warburton D, Dallaire L, Thangavelu M, et Al, Trisomy Recurrence: A Reconsideration Based on North American Data. Am J Hum Genet, 2004;75(3):376-85.

- Wertz DC, Ethical and legal implications of the new genetics: issue for discussion. Soc Sci Med 1992, 35(4):495-505.

- Whynes DK., Receipt of information and women ’s attitudes towards ultrasound scanning during pregnancy. Ultrasound Obstet Gynecol 2002, 19:7-12.